磷超標(biāo)是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因之一.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)總磷濃度超過(guò)0.1 mg · L-1(磷作為限制因素，mTN ∶ mTP>15 ∶ 1)，藻類(lèi)會(huì)過(guò)度繁殖;一般情況下，總磷濃度超過(guò)0.02 mg · L-1就有可能導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化. 由于水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重破壞了人類(lèi)賴(lài)以生存的自然環(huán)境，威脅著人類(lèi)的健康.常規(guī)的生化處理工藝效率低，不能從根本上解決問(wèn)題.近些年，微生物除磷工藝的研究得到了迅速發(fā)展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等.為實(shí)現(xiàn)微生物除磷工藝的有效實(shí)施，篩選出除磷能力較強(qiáng)的聚磷微生物是首要目標(biāo).此外，考慮到聚磷微生物對(duì)磷的吸收是一個(gè)厭氧釋磷、好氧吸磷的過(guò)程，有必要考察聚磷微生物對(duì)溶氧的響應(yīng). 同時(shí)，微生物聚磷過(guò)程會(huì)受有機(jī)質(zhì)分子大小、pH等的影響. 因此，考察特定微生物在不同理化條件下的生長(zhǎng)情況和除磷特性是實(shí)現(xiàn)微生物除磷機(jī)理研究及其在工程應(yīng)用的前提條件.
為獲得除磷能力較強(qiáng)的微生物種質(zhì)資源，自聚磷菌首次被分離以來(lái)，至今已有多種具備聚磷能力的微生物被篩選出來(lái).多項(xiàng)研究表明，產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌(Alcaligenes sp.)具備這方面的能力. 此外，腸桿菌(Enterobacteriaceae)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus)Accumulibacter、變形菌(Alphaprotenbacteria)等也是常見(jiàn)的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物. 在此基礎(chǔ)上，人們又開(kāi)展了大量關(guān)于溶氧對(duì)聚磷菌除磷能力的影響研究，但這些研究較少涉及不同聚磷菌在不同的厭氧時(shí)間條件下對(duì)好氧吸磷的相關(guān)作用.此外，諸如pH和有機(jī)質(zhì)分子大小等理化因素對(duì)聚磷菌聚磷能力的影響也已得到較深入研究. 然而，當(dāng)前的多數(shù)研究只局限于對(duì)單一因素的考察，抑或集中于研究高濃度廢水的生物處理系統(tǒng)，目前，聚磷微生物除磷工藝離工程應(yīng)用仍有較大的距離.正如研究表明，微生物的固定化能夠?yàn)槠浠钚猿至籼峁┍Ｕ? 然而，考察固定化聚磷菌對(duì)含磷廢水的修復(fù)實(shí)驗(yàn)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道. 因此，繼續(xù)篩選和開(kāi)發(fā)具備高效除磷功能的微生物，開(kāi)展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修復(fù)并開(kāi)展綜合理化因素對(duì)聚磷微生物除磷能力的影響等方面的研究對(duì)工程實(shí)踐有重要指導(dǎo)意義.
鑒于此，本研究從排污口淤泥中篩選出1株具備高效除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及除磷能力的影響. 同時(shí)，對(duì)微生物進(jìn)行固定化，并重點(diǎn)考察其對(duì)含磷廢水的凈化效果.
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 樣品來(lái)源
淤泥樣品采自福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)高岐村某排污口，立即用于菌種的分離與篩選.
2.1.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、微量元素，以及缺磷培養(yǎng)基和富磷培養(yǎng)基分別按文獻(xiàn)進(jìn)行配制.LB培養(yǎng)基(g · L-1)：蛋白胨 10.00，酵母粉5.00，NaCl 10.00，瓊脂2.00(固基加入)，pH=7.2.固定化微生物小球?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)基(g · L-1)：丁二酸鈉0.61，NaNO3 0.28，KH2PO4 0.1，KCl 0.014，MgSO4 · 7H2O 0.02，CaCl2 · 2H2O 0.018，pH =7.2.
以上所有培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃滅菌(碳源實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖和蔗糖組115 ℃滅菌)20 min后使用，微量元素于滅菌前加入.
2.1.3 微生物固定化小球制備材料
聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)、海藻酸鹽(Sodium alginate，SA)、硼酸(H3BO3)、無(wú)水氯化鈣(CaCl2)，除硼酸(分析純)外其余均為化學(xué)純.
2.2 方法
2.2.1 聚磷菌的分離鑒定
稱(chēng)取0.5 g新鮮淤泥，用無(wú)菌水水洗后8000 r · min-1離心5 min，棄上清，此過(guò)程重復(fù)3次. 處理后將樣品加入2.1.2節(jié)的富集培養(yǎng)基中，添加量及其他條件參考文獻(xiàn). 培養(yǎng)12 h后，取1.5 mL菌懸液于下一磷梯度的培養(yǎng)基中，磷梯度依次為2、5、8、10、15和20 mg · L-1(以P計(jì)).
聚磷菌含有典型的PHB顆粒和異染顆粒，經(jīng)強(qiáng)化釋磷、吸磷實(shí)驗(yàn)后，PHB顆?？杀恢苄匀玖咸K丹黑著色，異染顆?？杀患妆桨匪{(lán)和次甲基藍(lán)染成紫色，可與其他非顆粒性物質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái). 將富集馴化的菌懸液按10-1~10-7梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)坎计桨? 挑取形態(tài)較特殊的單菌落進(jìn)行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，確定含有PHB顆粒和異染顆粒的菌落，進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn).
挑取經(jīng)純化的單菌落于缺磷培養(yǎng)基中，150 r · min-1、30 ℃培養(yǎng)12 h.將菌液在8000 r · min-1條件下離心5 min，再將菌液轉(zhuǎn)接于富磷培養(yǎng)基中，150 r · min-1、30 ℃培養(yǎng)至菌液變渾濁. 計(jì)算各株菌的除磷率.此后，將復(fù)篩得到的聚磷菌根據(jù)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行16S rRNA的測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析.
2.2.2 理化因素對(duì)聚磷菌生長(zhǎng)及除磷特性的影響
聚磷菌具備高效除磷能力主要基于異染顆粒對(duì)磷的貯存，菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中也能夠利用部分磷合成細(xì)胞成分. 文獻(xiàn)報(bào)道顯示，聚磷菌在厭氧、缺磷條件下能夠把貯存于異染顆粒中的磷釋放出來(lái)，經(jīng)厭氧釋磷后將其投入富磷培養(yǎng)基中進(jìn)行除磷實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣叱啄芰? 此外，碳源、氮源、C/N、pH、溫度等都會(huì)影響聚磷菌的生長(zhǎng). 因此，考察不同理化因素對(duì)聚磷菌生長(zhǎng)及除磷能力的影響是必要的，這對(duì)實(shí)現(xiàn)聚磷菌的工程應(yīng)用有重要參考價(jià)值.
將菌株ED-12于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h(30 ℃、150 r · min-1)，按5%的接種量接種于裝有30 mL缺磷培養(yǎng)基(PO3-4-P質(zhì)量濃度為12.3 mg · L-1)的150 mL三角瓶中，30 ℃、150 r · min-1搖瓶培養(yǎng)12 h;再按5%的接種量將菌懸液接種于裝有30 mL富磷培養(yǎng)基(PO3-4-P質(zhì)量濃度為32 mg · L-1)的150 mL三角瓶中，30 ℃、150 r · min-1搖瓶培養(yǎng). 每隔一定的時(shí)間取樣測(cè)定菌株ED-12的OD600及剩余的PO3-4-P濃度，計(jì)算除磷率并繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖.
以聚磷菌的生長(zhǎng)特性為基礎(chǔ)，以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為唯一氮源，同時(shí)考察了不同C/N、起始pH和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)聚磷菌生長(zhǎng)及除磷能力的影響.在優(yōu)化過(guò)程中，已優(yōu)化的參數(shù)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件.此外，在最優(yōu)條件下，探討了菌株ED-12對(duì)不同起始濃度PO3-4-P的去除效果，以考察其工程應(yīng)用價(jià)值. PO3-4-P的起始濃度梯度設(shè)置為：5、15、30、45、60和100 mg · L-1.
2.2.3 微生物固定化小球的制備及除氮磷初步實(shí)驗(yàn)
微生物固定化小球的制備按以下步驟進(jìn)行：①稱(chēng)取4 g PVA(聚合度1750±50)溶于90 mL無(wú)菌水中，待PVA充分溶解后加入2 g SA，沸水浴加熱至完全溶解，冷卻至室溫備用; ②分別稱(chēng)取2 g反硝化菌和聚磷菌濕菌體，充分稀釋于10 mL無(wú)菌水中，再將稀釋后的菌液加入PVA-SA體系中，充分混勻;③根據(jù)需要的小球粒徑，剪去5 mL移液槍槍頭尖端，吸取菌體混合物，勻速滴入5%CaCl2-飽和硼酸溶液中，交聯(lián)15 min后，將小球用無(wú)菌水洗凈，備用.
以不添加菌球的組別為空白對(duì)照(Blank control)，以不添加微生物的固定化小球組為陽(yáng)性對(duì)照(PVA+SA)，按5%(m/V，g · L-1)投加小球. 24 h后取樣測(cè)定水樣的TN和TP濃度，計(jì)算脫氮除磷能力.
2.3 測(cè)定方法
硝態(tài)氮(NO-3)和總氮(TN)的測(cè)定采用麝香草酚分光光度法，總磷(TP)的測(cè)定采用鉬銻抗分光光度法.
2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
運(yùn)用Microsoft Excel 2003和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及繪圖. 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以Mean±SD表示.
3 結(jié)果與討論
3.1 聚磷菌的分離鑒定
3.1.1 聚磷菌的分離純化及復(fù)篩
經(jīng)富集，聚磷微生物在平板上的菌落隨著磷濃度的升高而減少，當(dāng)磷濃度達(dá)到20 mg · L-1時(shí)，平板上已無(wú)單菌落.將磷濃度為15 mg · L-1的培養(yǎng)基按10-1~10-7稀釋?zhuān)坎计桨? 根據(jù)形態(tài)特征，將能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的49個(gè)單菌落分成4類(lèi)，分別為EA(12株)、EB(15株)、EC(8株)和ED(14株). 分別對(duì)EA、EB、EC和ED進(jìn)行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，初篩得到9個(gè)染色效果較明顯的聚磷菌單菌落(EA、EB和ED各3個(gè)，EC無(wú)受染現(xiàn)象).
隨后，對(duì)EA、EB和ED共9株聚磷菌進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn). 分別缺磷培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接于富磷培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定除磷率，結(jié)果如表 1所示. 可知，ED-12對(duì)磷的去除能力最強(qiáng)，可達(dá)52.2%，因此，選擇菌株ED-12作進(jìn)一步研究.
表1 聚磷菌的除磷能力(起始濃度: 33.9 mg · L-1)
3.1.2 聚磷菌菌株ED-12的16S rRNA的PCR擴(kuò)增及序列分析
經(jīng)測(cè)序，獲得片段長(zhǎng)度為1463 bp的部分16S rRNA基因序列，GenBank登錄號(hào)為JX966315. 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果表明，該菌株與Alicaligenes sp.的相似性達(dá)98%以上，推測(cè)其為Alicaligenes sp. 選擇序列相關(guān)性較高的76個(gè)16S rRNA序列，用Cluxtal X序列分析軟件分析其與ED-12的序列同源可靠性，選9個(gè)可信度較高的序列用MEGA 4.0軟件通過(guò)N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定ED-12的進(jìn)化地位，結(jié)果如圖 1所示.
圖 1 基于16S rRNA 序列同源性構(gòu)建的菌株ED-12和親緣性相近的其他細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
3.2 ED-12的生長(zhǎng)曲線及除磷特性
聚磷菌在缺氧、缺磷條件下會(huì)利用異染顆粒中的磷并合成PHB，將其轉(zhuǎn)入有氧、富磷的培養(yǎng)基后會(huì)將PHB中的能量釋放出來(lái)，以便更高效地聚磷，用于菌體生長(zhǎng)并將剩余的磷儲(chǔ)存于異染顆粒中. 圖 2展示了菌株ED-12經(jīng)缺磷培養(yǎng)后在富磷培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，以及其對(duì)PO3-4-P的去除率. 結(jié)果表明，在前16 h，菌體生長(zhǎng)處于延滯期，16 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，52 h后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期. 在整個(gè)過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)特征與除磷率趨勢(shì)基本吻合. 64 h內(nèi)，磷濃度從30 mg · L-1左右降低到(8.12±0.32)mg · L-1，去除率達(dá)73.82%±1.02%. 此后，總磷濃度基本保持不變.
圖 2 菌株ED-12的生長(zhǎng)曲線及除磷特性
3.3 不同理化因素對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響 3.3.1 不同碳源對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
有機(jī)物特征是影響生物反應(yīng)器反硝化和除磷效果的重要因素，與反硝化微生物類(lèi)似，大部分聚磷菌只能以低級(jí)脂肪酸類(lèi)的小分子有機(jī)基質(zhì)作為碳源，并將其合成的PHB以能量形式儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi).
以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力結(jié)果如圖 3所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)基本不生長(zhǎng)，對(duì)PO3-4-P的去除率低于15%. 而菌株在以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉為碳源時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較好，且對(duì)PO3-4-P的去除率都在50%以上. 其中，以乙酸鈉為碳源時(shí)，菌株ED-12生長(zhǎng)最旺盛，對(duì)PO3-4-P的去除率達(dá)到了70%以上. 對(duì)比5種碳源結(jié)構(gòu)與分子量，相對(duì)而言，在分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量低的情況下，聚磷菌的生長(zhǎng)較好，且能達(dá)到一個(gè)較高的除磷率，這與前述觀點(diǎn)相符. 此外，聚磷菌對(duì)不同碳源的利用效果可能還與其本身對(duì)碳源的親和性或其他特性有關(guān).
圖 3 不同碳源對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
3.3.2 不同氮源對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
氮源是微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的第二大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和其他一些成分的合成非常重要. 多數(shù)細(xì)菌能以氨鹽作為唯一氮源，由圖 4可知，在以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為唯一氮源的培養(yǎng)基中，聚磷菌能夠良好生長(zhǎng). 其中，在含有NH4Cl的培養(yǎng)基中OD600可在24 h內(nèi)達(dá)到1.4左右. 同時(shí)，在以上3種氮源培養(yǎng)基中，菌株ED-12對(duì)PO3-4-P的去除率都在45%以上(NH4Cl培養(yǎng)基最高，可達(dá)80%). 觀察發(fā)現(xiàn)，菌株ED-12在24 h時(shí)，在以NaNO3和NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基中只能微弱的生長(zhǎng)，但經(jīng)48 h的培養(yǎng)后，開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，并能達(dá)到較高的OD600. 此外，雖然以NaNO3和NaNO2為唯一氮源時(shí)微生物生長(zhǎng)情況較差，但培養(yǎng)基中PO3-4-P濃度分別降低了63.72%±5.57%和34.84%±2.11%，說(shuō)明微生物在24 h內(nèi)主要通過(guò)分解PHB并將磷儲(chǔ)存于異染顆粒中在后期用于菌體的生長(zhǎng). 但研究認(rèn)為，NO-2的存在在有氧和無(wú)氧兩種情況下都會(huì)抑制聚磷菌對(duì)磷的吸收. 圖 4得出了不同的結(jié)論，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究. 在以蛋白胨為唯一氮源的培養(yǎng)基中，菌株ED-12長(zhǎng)勢(shì)較好，但蛋白胨含有含磷雜質(zhì)，因而影響了PO3-4-P去除率的計(jì)算.
圖 4 不同氮源對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
由此可知，聚磷菌ED-12菌株能夠在以NH4Cl、NaNO3、NaNO2、(NH4)2SO4、蛋白胨和NH4NO3為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng).根據(jù)微生物生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)周期及對(duì)PO3-4-P的去除率，NH4Cl是菌株ED-12生長(zhǎng)及發(fā)揮除磷能力的最佳氮源.
3.3.3 不同C/N對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)的重要物質(zhì)，不同微生物對(duì)碳源和氮源的需求量不同. 細(xì)菌對(duì)氮源的需求量大，真菌和放線菌等對(duì)碳源的需求量大. 在脫氮除磷工藝中，必須考慮C/N以實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)廢水中氮、磷的有效利用.
考察C/N對(duì)聚磷菌ED-12菌株生長(zhǎng)及除磷能力的影響，結(jié)果(圖 5)表明，隨著C/N的升高，菌體生物量增大，同時(shí)對(duì)PO3-4-P的去除率也隨之提高，C/N為3 ∶ 1時(shí)達(dá)到最大值. 此后，微生物的生長(zhǎng)及對(duì)PO3-4-P的去除率又隨著C/N的升高而緩慢降低，說(shuō)明過(guò)高的C/N導(dǎo)致氮源不足，微生物生長(zhǎng)也因此受到了抑制.
圖 5 不同C/N對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
3.3.4 不同pH對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
在好氧條件下，聚磷菌能分別以醋酸和PO3-4為碳源和磷源，生成聚合態(tài)磷作為儲(chǔ)能物質(zhì)，儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)并伴隨著產(chǎn)生OH-，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值逐漸升高. 其聚磷過(guò)程可用式(1)表示.
圖 6 不同起始pH對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
3.3.5 不同溫度對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
溫度是除有機(jī)物特征外影響微生物生長(zhǎng)的另一重要因素，但王亞宜等(2006)和姜體勝等(2007)認(rèn)為，溫度不會(huì)影響聚磷菌發(fā)揮聚磷作用.
由圖 7可知，隨著溫度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，35 ℃時(shí)最適宜ED-12菌株的生長(zhǎng). 相應(yīng)地，ED-12菌株對(duì)PO3-4-P的去除率也呈先增后減的趨勢(shì)，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值(73.14%±1.65%). 由此可知，不同溫度對(duì)聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影響比對(duì)其生長(zhǎng)的影響大得多.溫度對(duì)聚磷效果存在影響，這與Panswad等(2003)的研究結(jié)果相符，即35 ℃最有利于聚磷菌發(fā)揮聚磷作用，過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)抑制其效果，說(shuō)明不同的微生物聚磷特性存在差異.
圖 7 不同溫度對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
3.3.6 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株ED-12的生長(zhǎng)及除磷能力的影響
研究表明，溶氧是影響生物除磷效果的一個(gè)重要因素. 為了滿足聚磷菌生物膜內(nèi)對(duì)氧的需求量，加快氧的傳遞速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必須提高液相主體中溶解氧的含量. 此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷(在含硝酸鹽或亞硝酸鹽培養(yǎng)中可以進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)).
如圖 8所示，搖床轉(zhuǎn)速在0~200 r · min-1之間，菌株ED-12都能生長(zhǎng). 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r · min-1時(shí)，菌體OD600最高，達(dá)2.60±0.62;當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r · min-1時(shí)，對(duì)PO3-4-P的去除率最高，達(dá)59.05%±7.26%. 在各培養(yǎng)條件下，菌體的生長(zhǎng)與除磷率趨勢(shì)不盡相同，說(shuō)明二者是彼此獨(dú)立的過(guò)程.靜置培養(yǎng)時(shí)，儲(chǔ)存于異染顆粒的磷被分解，用于菌體的生長(zhǎng)，此時(shí)對(duì)PO3-4-P的去除率近50%，說(shuō)明菌株ED-12在厭氧條件下還能將環(huán)境中的磷用于生長(zhǎng). 好氧條件下，菌體將部分磷用于生長(zhǎng)，并將剩余的磷儲(chǔ)存于異染顆粒中，因此，在轉(zhuǎn)速≥50 r · min-1時(shí)也能維持一個(gè)較高的除磷率. 觀察發(fā)現(xiàn)，搖床轉(zhuǎn)速過(guò)高未必能提高除磷率.
圖 8 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株ED-12生長(zhǎng)及除磷能力的影響
微生物固定化小球脫氮除磷實(shí)驗(yàn)表明(詳見(jiàn)3.5節(jié))，ED-12菌株在低溶氧與高溶氧時(shí)都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的強(qiáng)弱導(dǎo)致了圖 8所示的結(jié)果，即高溶氧時(shí)對(duì)PO3-4-P的去除率與低溶氧時(shí)相近. 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r · min-1時(shí)，培養(yǎng)基中的溶氧最適合ED-12菌株對(duì)磷的反硝化去除或儲(chǔ)存于異染顆粒中.低溶氧和高溶氧條件下，則分別表現(xiàn)為對(duì)磷的生長(zhǎng)利用和積聚. 因此，對(duì)廢水中的磷的有效去除可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶氧而實(shí)現(xiàn)，此過(guò)程包括生長(zhǎng)利用和聚磷作用.
3.4 菌株ED-12對(duì)不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
聚磷菌對(duì)磷的去除包括兩條途徑：生長(zhǎng)利用和異染顆粒貯磷.根據(jù)聚磷菌分離篩選原理，過(guò)高濃度的PO3-4-P會(huì)抑制聚磷菌的生長(zhǎng)與繁殖. 因此，考察不同起始濃度的PO3-4-P對(duì)聚磷菌生長(zhǎng)的影響及相應(yīng)條件下聚磷菌對(duì)PO3-4-P的去除效果，對(duì)分析聚磷菌生長(zhǎng)與聚磷過(guò)程的關(guān)系及指導(dǎo)聚磷菌在富營(yíng)養(yǎng)化水體中的工程應(yīng)用有實(shí)際意義.
如圖 9所示，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12的OD600呈先增后減的趨勢(shì). 當(dāng)PO3-4-P濃度為45 mg · L-1時(shí)，菌株ED-12的長(zhǎng)勢(shì)最好，過(guò)高的PO3-4-P反而會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng).這是由于微生物生長(zhǎng)受到了基質(zhì)自抑制作用，這與聚磷菌分離篩選的結(jié)論相符. 觀察發(fā)現(xiàn)，除5 mg · L-1組，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12對(duì)PO3-4-P的去除率與聚磷菌生物量成正相關(guān)(圖中未顯示)，但PO3-4-P的變化濃度始終呈一遞增趨勢(shì). 當(dāng)PO3-4-P濃度>45 mg · L-1時(shí)，培養(yǎng)基中出現(xiàn)了部分沉淀物. 正如3.3.4節(jié)的結(jié)論，聚磷過(guò)程會(huì)釋放OH-，微生物生長(zhǎng)越快，在相同的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的OH-也越多，因此，就有越多的PO3-4-P形成了沉淀，這合理地解釋了以上的現(xiàn)象.以上結(jié)論說(shuō)明，Alcaligenes sp. ED-12對(duì)磷的吸收是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在菌體生長(zhǎng)及聚磷過(guò)程中，不僅會(huì)受理化因素尤其是pH的影響，溶液中的磷濃度也是影響聚磷菌生長(zhǎng)與聚磷效果的一個(gè)關(guān)鍵因素. 由以上分析可知，菌株ED-12對(duì)PO3-4-P的去除能力很強(qiáng)，在不同PO3-4-P起始濃度梯度條件下，最高去除率可達(dá)81.02%±2.27%，此時(shí)的PO3-4-P濃度變化量為(36.46±1.02)mg · L-1.
圖 9 菌株ED-12對(duì)不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
表 2所示為典型的聚磷菌對(duì)不同起始濃度PO3-4-P的去除效果. 由表可知，除耳葡萄球菌(Staphyloccocus auricularis)、Accumulibacter和Competibacter外，其他菌株對(duì)濃度<50 mg · L-1的PO3-4-P去除效果一般. 在當(dāng)前所報(bào)道的產(chǎn)堿桿菌除磷能力實(shí)驗(yàn)中，都未開(kāi)展磷濃度梯度實(shí)驗(yàn);除Bao等(2007)的報(bào)道外，其余產(chǎn)堿桿菌菌株對(duì)濃度<30 mg · L-1的PO3-4-P去除效果都低于90%. 本研究所得菌株不僅在磷濃度為45 mg · L-1時(shí)具有較高的去除率，當(dāng)濃度高達(dá)60 mg · L-1甚至100 mg · L-1時(shí)還能維持較高的活性及去除率. 因此，菌株ED-12是一株較理想的聚磷菌，具有廣闊的應(yīng)用前景. 然而，微生物聚磷過(guò)程比較復(fù)雜，今后的研究工作可圍繞精確定量菌株Alcaligenes sp. ED-12的磷吸收在生長(zhǎng)利用及貯存方面的比例及吸收與釋放的關(guān)系上.
表2 不同微生物對(duì)磷的去除效率
微生物PO3-4-P起始濃度/
(mg·L-1)PO3-4-P去除率參考文獻(xiàn)
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)1065%南亞萍等，2013
耳葡萄球菌(Staphyloccocus auricularis)50>90%Choi et al., 2000
腸桿菌(Enterobacter sp.)10.2594.6%張培玉等，2011
Accumulibacter & Competibacter53.3>80%Oehmen et al., 2005
克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)27<80%趙海泉等，2009
約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii)1065.24%連麗麗，2009
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)7.590%劉亞男等，2005
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)10>90%Bao et al., 2007
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)20.2582.3%孫夢(mèng)，2011
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)28.7377.1%焦中志等，2009
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)4581%本研究
3.5 固定化聚磷微生物小球除氮磷實(shí)驗(yàn)
微生物的固定化是實(shí)現(xiàn)微生物活性持留的途徑之一，同時(shí)，固定化也有助于目標(biāo)微生物的投加與回收. 當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的固定化材料是聚乙烯醇和海藻酸鹽，固定化交聯(lián)劑通常選擇2%~5%的CaCl2-飽和硼酸溶液.
根據(jù)賴(lài)子尼等(2008)的實(shí)驗(yàn)配方制備的固定化聚磷微生物小球的彈性與機(jī)械強(qiáng)度較好，對(duì)含氮磷廢水的凈化效果表明，菌球?qū)α子休^強(qiáng)的去除能力(從(19.91±1.81)mg · L-1 降至(6.19±0.76)mg · L-1)，同時(shí)能夠去除一定的氮(從(215.82±35.29)mg · L-1 降至(183.42±15.35)mg · L-1)(圖 10 a). 二者的去除率分別達(dá)56.21%和15.01%(圖 10 b). 其中，固定化材料對(duì)氮的吸附比例較小，而對(duì)磷的吸附較顯著(p<0.01)，這可能與固定化材料的表面官能團(tuán)及CaCl2等對(duì)PO3-4的親和力強(qiáng)于NO-3有關(guān). 同時(shí)，固定化微生物(IMOs)對(duì)磷的去除效果也優(yōu)于氮，說(shuō)明菌株ED-12可能不具備反硝化能力，對(duì)氮的利用僅是生長(zhǎng)所需. 由PVA+SA+IMOs組與PVA+SA組比較可知(圖 10b，#表示)，無(wú)論是氮還是磷，都存在顯著差異，說(shuō)明固定化微生物是氮磷去除的主要貢獻(xiàn)者.
圖 10 固定化聚磷微生物小球?qū)Φ椎娜コЧ?/p>
4 結(jié)論
1)本研究成功從高岐村某排污口篩選出1株典型的聚磷微生物，鑒定發(fā)現(xiàn)其屬于產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)細(xì)菌，將其命名為Alcaligenes sp. ZGED-12.
2)研究發(fā)現(xiàn)，菌株ED-12能在高磷濃度下生長(zhǎng)，16 h時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期. 理化因素實(shí)驗(yàn)確定了聚磷菌ED-12的最適生長(zhǎng)及發(fā)揮除磷能力的條件，其中，碳源、氮源和pH對(duì)其影響最大.磷濃度實(shí)驗(yàn)表明，低濃度磷不利于菌株ED-12的生長(zhǎng)，但過(guò)高濃度反而會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)及發(fā)揮聚磷功能，最優(yōu)磷濃度為45 mg · L-1.
3)本研究成功實(shí)現(xiàn)了聚磷微生物的固定化，該固定化小球?qū)Φ椎娜コ@示出了良好的效果，作用機(jī)理包括固定化材料對(duì)氮磷的物理化學(xué)吸附及微生物的吸收利用(或貯存). 其中，微生物在這個(gè)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用.
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